Elisa试剂盒实验常见问题分析

Elisa试剂盒实验常见问题分析

　　1、ELISA试剂盒试验出现非常弱的结果，常见有7种原因，其解决方法如下：

　　1)可能原因：温育的时间或者温度不够；

　　解决方法：校正温育箱温度。

　　2)可能原因：显色反应时间太短；

　　解决方法：校正定时钟准确定时。

　　3)可能原因：所用配制缓冲液的蒸馏水有问题；

　　解决方法：使用新鲜合格的蒸馏水。

　　4)可能原因：加入/酶的稀释液浓度太低；

　　解决方法：按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。

　　5)可能原因：酶标仪滤光片不正确；

　　解决方法：检查酶标仪使用的滤光片。

　　6)可能原因：试剂盒没有充分平衡；

　　解决方法：试剂室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温。

　　7)可能原因：不正确的试剂储存方式；

　　解决方法：按照说明书要求保存试剂盒。

　2、ELisa试剂盒试验的标准曲线和测定的重复性差，这是什么原因造成的？

　　答：试验的标准曲线和测定的重复性差，这是典型的由测定操作引起的问题，常见原因如下：

　　a)可能原因：加样本及试剂量不准；孔间不一致；

　　解决方法：校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。

　　重复某一样品时，加样时间尽可能与次接近；

　　重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；

　　样品稀释前应充分混匀。

　　b)可能原因：加样过快，孔间发生污染；

　　解决方法：重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；加样不要过快。

　　c)可能原因：加错样本；

　　解决方法：检查记录和试剂，是否加错样本。

　　d)可能原因：加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；

　　解决方法：加样枪头不要贴壁。

　　e)可能原因：不同批号试剂盒中组分混用；

　　解决方法：不同批号试剂盒中组分不可混用。

　　f)可能原因：温育时间、洗板、显色时间不一致；

　　解决方法：检查时间是否一致。

　　g)可能原因：孔内污染杂物；

　　解决方法：离心样品，排除杂物。

　　h)可能原因：试剂/样品没有混匀；

　　解决方法：充分混匀样品和试剂。

　　i)可能原因：血清标本未*凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血

　　细胞，易出现假阳性反应等。

　　解决方法：待血清标本*凝固后做试验。

　　3、 试验结果白板，而且阳性对照不显色，应如何分析和查找原因？

　　答：试验结果白板，而且阳性对照不显色，常见原因如下：

　　a)可能原因：漏加或者误加试剂；

　　解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。

　　b)可能原因：试剂过期；

　　解决方法：使用有效期内的产品。

　　c)可能原因：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物（叠氮钠

　　等）；

　　解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂。

　　d)可能原因：温育的时间或温度不够；

　　解决方法：校正温育箱温度。

　　e)可能原因：标准品失活或者丢失；

　　解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀。

　　f)可能原因：失活或者丢失；

　　解决方法：更换或者提高浓度

　　g)可能原因：酶失活或者丢失

　　检查方法：把工作浓度的酶再稀释20－100倍，取5uL加入50ul的显色底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。

　　解决方法：更换酶或者提高酶的浓度。

　　h)可能原因：显色底物失活

　　检查方法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色。

　　解决办法：更换显色底物.

4. Elisa试剂盒试验结果空白背景高，这是什么原因造成的？

　　答：试验结果空白背景高，常见原因如下：

　　a)可能原因：洗板不干净；

　　解决方法：充分洗涤，*拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；吸嘴尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。

　　b)可能原因：显色液变质或者试剂过期；

　　解决方法：检查试剂盒有效期。

　　c)可能原因：试剂稀释有误，如加酶的浓度过高；

　　解决方法：请按说明书所示稀释倍数配制；

　　d)可能原因：蒸馏水受酶等污染；

　　解决方法：使用新鲜蒸馏水；

　　e)可能原因：试剂混用；

　　解决方法：不同批号试剂勿混用。

　　f)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应时间过长。

　　解决方法：显色反应时间适当缩短。